基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）明膠酶譜法電泳分析試劑盒說明書

1. 簡介：

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解細胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的MMP-2、MMP-9參與各種理與病理過程，其在臨床診斷和治療中的意義日益受到重視。

2. 檢測原理：

本試劑盒采用酶譜法(Zymography)檢測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是一種廣為使用的、基于SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達1 nM，高于ELISA方法，其基本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進行電泳，電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng)Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學反應(yīng)緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行50次標準小膠檢測，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢測500~750個樣品。

3. 檢測目的:

本試劑盒用于檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4.  試劑盒組成與儲存：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, −20 ºC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, −20 ºC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 ºC, 使用時用蒸餾水稀釋；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液, 4 ºC。

5.檢測步驟：

5.1 制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標準程序制備SDS PAGE凝膠。將10 × substrate G 融化，并90 ºC 加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10 × substrate G 并使之稀釋10倍，混勻后加入過硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl  pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預試驗確定加樣量，使用普通蛋白預染Marker 即可。

陽性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體積混合，取5-15μl 上樣。

注：因為全血成分復雜,MMP活性較低，的方法是將全血中白細胞進行分離做陽性對照

5.3 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠前沿時結(jié)束電泳。

5.4 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠2 × 30 分鐘。中間換液。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或37ºC 孵育1~5 小時。陽性對照或者血中的MMP 通常37ºC 孵育1 小時即可顯示。如MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時間為10小時或過夜。

5.6 顯色：倒掉Buffer B，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液（操作步驟見后面所附SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。

透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。陽性對照將在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位置出現(xiàn)透明條帶。

5.7 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP 條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

6.說明：

1. 10 mM 能夠EDTA*抑制MMP活性。

2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置室溫快速干燥凝膠，作為*記錄保留。

7.參考文獻：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍染色液說明書

常規(guī)考馬斯亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實驗室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度高，但所需試劑復雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即為工作液，使用時直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍染色液覆蓋凝

膠，并緩慢搖動2h；

2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；

3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進行脫色，直至獲得清晰的藍色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要2～4h，也可脫色過夜至清晰的藍色的條帶和干凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對

凝膠進行處理后保存。

安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學品操作規(guī)程處理。

說明：

1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至1000ml，混合1h 后用

Whatman 1 號濾紙過濾，于室溫可無限期保存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰醋酸；

4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nèi)，室溫或4 ºC 保存，可反復使用2-4 次。